Genética Molecular

2. Funciones del ADN

El ADN es la molécula de la información genética. Cumple dos funciones principales:

• Transmisión hereditaria (Replicación): Pasar la información de una generación a la siguiente. Para ello, el ADN se copia a sí mismo (replicación) antes de la división celular, de modo que cada célula hija contenga la misma información genética.
• Expresión génica: Expresar su información para que la célula sea capaz de sintetizar las proteínas necesarias. Este proceso de expresión génica ocurre en dos etapas: Transcripción y Traducción.

El Dogma Central de la Biología Molecular

Este flujo de información fue propuesto por Crick en 1970 y enunciado como el Dogma Central de la Biología.

Se descubrió que los virus que tienen ARN como material genético representan excepciones al dogma. La molécula de ARN sirve como molde para la síntesis de ADN (retrotranscripción) por medio de una enzima, la transcriptasa inversa. Otra excepción la constituyen los virus con ARN capaces de generar ARN complementarios mediante la enzima replicasa de ARN.

3. Replicación del ADN

Es el proceso por el que el material genético se copia a sí mismo para obtener dos copias idénticas y asegurar que la información genética se mantenga constante de generación en generación.

3.1. Hipótesis sobre el Mecanismo de Replicación

Existen varias hipótesis sobre cómo ocurre el proceso de replicación:

• Hipótesis conservativa: Una doble hélice conserva las dos cadenas originales, y la otra está formada por dos cadenas de nueva síntesis.
• Hipótesis dispersiva: Cada una de las cadenas hijas contiene fragmentos de la cadena original y fragmentos de nueva síntesis.
• Hipótesis semiconservativa: Cada doble hélice conserva una cadena de las originales y otra de nueva síntesis.

3.2. Síntesis de Nuevas Cadenas de ADN

La doble hélice se desenrolla y cada hebra sirve de molde para fabricar una nueva cadena complementaria. El resultado es la formación de dos moléculas de ADN iguales entre sí e iguales a la molécula original, cada una de ellas compuesta por una hebra original y otra de nueva síntesis.

Para la síntesis de una nueva cadena de ADN se necesita:

• Desoxirribonucleótidos 5′-fosfato (dNTP) de A, G, C y T.
• Iones Mg²⁺ como cofactores enzimáticos.
• Una hebra que sirva de molde.
• Enzimas ADN polimerasas para leer la hebra molde y sintetizar una cadena complementaria. (Existen varios tipos de ADN polimerasas: I, II y III).
• Un fragmento que actúa como cebador o iniciador de la nueva cadena, ya que las ADN polimerasas son incapaces de sintetizar una cadena “de novo”. Estos cebadores son sintetizados por ARN polimerasas.
• Otras enzimas auxiliares: ligasas, topoisomerasas, helicasas y primasas.

3.2.1. Replicación en Procariotas

El proceso comienza en un punto determinado (Ori C) en el que aparece una secuencia de nucleótidos llamada señal de replicación (GATC). A partir de aquí, se forman unas estructuras conocidas como burbujas de replicación que se extienden a lo largo del cromosoma, en sentidos contrarios. Se forman dos horquillas de replicación, en las cuales, las dos hebras de ADN parental están separadas y actúan como moldes para la síntesis de las nuevas cadenas. La replicación es bidireccional.

Apertura de la Doble Hélice

Intervienen las siguientes enzimas y proteínas:

• Enzimas Helicasas: Rompen los puentes de hidrógeno (H) que se establecen entre las bases nitrogenadas (BN) y abren la doble hélice.
• Enzimas Girasas y Topoisomerasas: Amortiguan el superenrollamiento que se origina en el resto de la molécula de ADN cuando la doble hélice se abre y se desenrolla.
• Proteínas SSB (Single-Strand Binding): Estabilizan la burbuja de replicación, evitando que las hebras se vuelvan a enrollar.

Síntesis de las Nuevas Cadenas de ADN

La síntesis comienza cuando una ARN polimerasa fabrica un cebador o primer (de unos 10 nucleótidos). A continuación, la ADN polimerasa III añade al primer los nucleótidos complementarios a los que aparecen en la hebra molde.

Se emplean nucleótidos trifosfatados que pierden dos fosfatos y liberan la energía necesaria para unir los nucleótidos a la cadena. La ADN polimerasa III lee la cadena molde en sentido 3’→5′ y la nueva cadena crece en sentido 5’→3′.

Esto plantea un problema, pues de las dos hebras molde:

• La hebra orientada en sentido 3’→5′ es copiada de manera continua (la réplica recibe el nombre de hebra conductora).
• La otra hebra molde, al ser antiparalela (orientación 5’→3′), no puede ser leída continuamente por la ADN polimerasa III. En este caso, la nueva cadena se sintetiza de forma discontinua en pequeños fragmentos en sentido 5’→3′, a partir de numerosos cebadores. Estos fragmentos reciben el nombre de fragmentos de Okazaki (la réplica recibe el nombre de hebra retardada).

Posteriormente, interviene la ADN polimerasa I que, gracias a su actividad exonucleasa, elimina los cebadores de ARN y los sustituye por una secuencia de ADN complementaria a la hebra molde (actividad polimerasa). Finalmente, interviene una ADN ligasa que une los diversos fragmentos de ADN.

3.2.2. Replicación en Eucariotas

Transcurre del mismo modo que en procariotas, pero con algunas diferencias clave:

• Intervienen más de 5 tipos de ADN polimerasas.
• Existen más de 100 orígenes de replicación, llamados replicones (el ADN es más largo).
• Además de replicarse el ADN, hay que duplicar las histonas, las cuales formarán nucleosomas en la hebra retardada.
• Los fragmentos de Okazaki son más cortos (entre 150-200 nucleótidos, mientras que en procariotas son entre 1000 – 2000 nucleótidos).
• Al ser ADN lineal, intervienen unas ribonucleoproteínas, las cuales contienen una hebra de ARN que sirve de molde para la síntesis de los telómeros (extremos). La enzima telomerasa añade esta secuencia al extremo 5′ de la nueva hebra, evitando el acortamiento de las hebras en cada replicación.

3.3. Corrección de Errores (Fidelidad de la Replicación)

La replicación debe ser un proceso fiel, pues se tiene que evitar que haya errores en el apareamiento de bases. Las ADN polimerasas tienen actividad correctora, y además existe una maquinaria enzimática que corrige los posibles errores cometidos en la síntesis.

Para diferenciar la hebra molde de la hebra nueva, la primera tiene metiladas las adeninas de determinadas secuencias (GATC).

4. Expresión Génica

En general, podemos asociar la expresión de un gen con la síntesis de una proteína o de una cadena polipeptídica.

En 1941, Beadle y Tatum dedujeron que una mutación en un gen afectaba a una enzima, proponiendo la hipótesis de un gen – una enzima. Esta relación se matizó quedando como un gen – un polipéptido.

La relación entre gen y polipéptido se materializó en el principio de colinealidad, según el cual, la secuencia de nucleótidos de un ADN se corresponde con la secuencia de aminoácidos del polipéptido.

El proceso de expresión de un gen requiere a su vez dos procesos: transcripción y traducción.

4.1. Transcripción

Consiste en la síntesis de los diversos tipos de ARN a partir de la información contenida en el ADN.

Para la transcripción se necesita:

• Una hebra de ADN que actúe como molde. La otra hebra es informativa.
• Ribonucleótidos 5′-fosfato (NTP) de A, G, C y U.
• ARN polimerasas que catalizan la polimerización de ribonucleótidos. Esta enzima debe ser capaz de reconocer la secuencia promotora que marca el inicio de la transcripción y las secuencias de terminación que marcan el final del proceso.
• Factores de transcripción.

Transcripción en Procariotas

Existe una sola ARN polimerasa para sintetizar los distintos tipos de ARN. El proceso comienza cuando la ARN polimerasa, unida al factor σ, se une al ADN en la región promotora. Esta región se sitúa antes del gen que se va a transcribir y contiene ciertas secuencias de consenso que actúan de reconocimiento.

A continuación, la ARN polimerasa desenrolla una vuelta de la hélice y recorre la hebra molde en sentido 3’→5′, sintetizando una hebra de ARN en sentido 5’→3′. Cuando comienza la transcripción, el factor σ se separa.

La síntesis finaliza cuando la enzima alcanza una secuencia en el ADN de G y C palindrómica. Esta secuencia se aparea consigo misma formando un bucle y la cadena de ARN se separa del molde. En el caso de que no exista secuencia de terminación, la síntesis acaba cuando se une el factor rho a la polimerasa.

Los ARN mensajeros son policistrónicos, es decir, contienen la información para la síntesis de varias cadenas polipeptídicas. Los genes implicados en la misma ruta metabólica suelen estar agrupados de manera continua, de forma que su transcripción está regulada por el mismo promotor.

Transcripción en Eucariotas

El proceso es similar al de procariotas, pero con algunas diferencias:

• La transcripción ocurre en el núcleo y no en el citoplasma.
• Hay tres clases de ARN polimerasas:
  • ARN polimerasa I: para ARNr.
  • ARN polimerasa II: para ARNm.
  • ARN polimerasa III: para ARNt y ARNr-5s.
• Los genes están fragmentados, de manera que encontramos secuencias sin sentido (intrones) y secuencias con sentido (exones).
• Además del promotor, aparecen secuencias potenciadoras y silenciadoras que modulan la velocidad de la transcripción.
• En la iniciación de la transcripción, la ARN polimerasa necesita de unos factores proteicos (factores basales) para unirse al promotor.
• Todos los ARN transcritos sufren maduración postranscripcional:
  • Caperuza (Cap): Al inicio de la transcripción, se añade un nucleótido metilado (7-metil-guanosina-trifosfato o 7mGppp) en el extremo 5′. Sus funciones son proteger el extremo 5′ del ataque de las nucleasas y transportar el ARNm al citoplasma.
  • Cola de poliA: Al final de la transcripción, la enzima poliA polimerasa añade al extremo 3′ un segmento de unos 200 nucleótidos de adenina.
  • Splicing: El proceso mediante el cual los intrones son eliminados se denomina splicing y supone un proceso de corte y empalme en el que se cortan los intrones y se unen los exones.

4.2. Retrotranscripción

Es un proceso que solo aparece en los llamados retrovirus y consiste en la síntesis de una molécula de ADN a partir de una hebra de ARN, gracias a una enzima llamada retrotranscriptasa.

Este descubrimiento supuso un duro golpe para la biología molecular, ya que contradecía la idea de que el flujo de información fluye exclusivamente del ADN al ARN y de este a las proteínas (Dogma Central de la Biología).

4.3. Biosíntesis de Proteínas (Traducción)

La traducción es un proceso metabólico muy complejo y energéticamente costoso. Consiste en la síntesis de proteínas a partir de las instrucciones contenidas en la molécula de ARNm, la cual proviene del proceso de transcripción.

4.3.1. El Código Genético

Se conoce como código genético a la correspondencia entre la secuencia de bases en el ARNm y la secuencia de aminoácidos (aa) en una proteína. Los aa están codificados por paquetes de tres nucleótidos que reciben el nombre de triplete o codón.

El código genético se caracteriza por:

• Universalidad: Es usado por todos los seres vivos.
• No ambigüedad: Cada codón siempre significa lo mismo.
• Degeneración: Varios codones pueden significar el mismo aminoácido. Esto se debe a que existe una relajación en la interacción de la tercera base del anticodón del ARNt, conocida como balanceo de la tercera base.
• No solapamiento: En su lectura no se producen solapamientos, es decir, se leen de tres en tres.
• De los 64 codones existentes, 61 codifican aminoácidos y 3 son secuencias de terminación.

4.3.2. El Proceso de Traducción

La traducción se realiza en el interior de los ribosomas. Las moléculas encargadas de establecer la correspondencia entre los codones del ARNm y los aa de las proteínas son los ARNt. Estas moléculas son capaces de reconocer, por un lado, a un aa concreto, y por otro, de reconocer los codones del ARNm a través de una secuencia de tres nucleótidos que se llama anticodón.

El proceso consta de varias etapas:

Activación de Aminoácidos

Ocurre fuera del ribosoma. La enzima ARNt sintetasa cataliza la unión de un aminoácido, por su extremo carboxilo, con la región 3′ de su ARNt correspondiente, con la ayuda de una molécula de ATP. Estas enzimas son específicas para cada aa y poseen dos sitios activos: uno se encarga de reconocer al aa y el otro identifica el ARNt correspondiente.

Iniciación de la Síntesis

El ARNm que se va a traducir se une a la subunidad menor del ribosoma gracias a una secuencia inicial o secuencia líder, y a la presencia de unos factores de iniciación (FI) por el extremo 5′.

La síntesis comienza con el triplete 5’AUG3′ que corresponde con Metionina (Met) en eucariotas y Formilmetionina (fMet) en procariotas. Cuando encaja el ARNt complementario a la secuencia AUG en su anticodón, y cargado con el aa Met (ARNt^Met), se liberan los factores de iniciación y la subunidad mayor del ribosoma se une al complejo anterior para formar el ribosoma completo y funcional.

En el ribosoma completo aparecen dos huecos:

• Sitio P (Peptidil): Queda ocupado por el ARNt^Met.
• Sitio A (Aminoacil): Está libre para recibir un segundo ARNt.

Elongación de la Cadena

Este proceso es catalizado por la enzima peptidiltransferasa.

1. Fase 1: Llega al sitio A un ARNt cargado con su aa, que tenga en su anticodón la secuencia complementaria al segundo triplete.
2. Fase 2: La peptidiltransferasa cataliza la unión del aa Met con el aa del segundo ARNt (sitio A) mediante un enlace peptídico. El resultado es un dipéptido unido al ARNt alojado en el sitio A.
3. Fase 3 (Translocación): Con la ayuda suministrada por GTP, el ribosoma se desplaza tres nucleótidos a lo largo del ARNm en sentido 5’→3′. El ARNt del sitio P (que ahora está libre de aa) sale del ribosoma. El segundo ARNt (cargado con los dos aa) se desplaza del sitio A al sitio P, de modo que el sitio A queda vacío, a la espera del siguiente ARNt que posea en su anticodón la secuencia complementaria al codón del ARNm.

Este proceso se repite muchas veces hasta que todos los codones del ARNm han sido traducidos. Intervienen factores de elongación (FE).

Terminación de la Síntesis

La síntesis proteica se detiene cuando aparece en el sitio A uno de los tres codones de terminación del ARNm. En este momento se unen factores de terminación (FT) al sitio A, y la enzima peptidiltransferasa cataliza la transferencia de la cadena polipeptídica a una molécula de agua. El último ARNt se libera y las subunidades del ribosoma se separan.

Maduración Postraduccional

Conforme se va sintetizando una cadena polipeptídica, esta comienza a plegarse en sus estructuras secundarias y terciarias, gracias a la presencia de unas proteínas que tienen como función que las cadenas adopten una conformación espacial determinada. Se llaman proteínas de choque térmico (chaperonas).

La cadena peptídica posee en el extremo N-terminal (principio) una secuencia señal que indica el destino de la proteína. Así:

• Las enzimas metabólicas y las proteínas que se van a mandar a los orgánulos se sintetizan a partir de ribosomas libres en el citoplasma.
• Las proteínas que van a formar parte de la membrana celular o van a ser transportadas al exterior celular se sintetizan en ribosomas asociados al Retículo Endoplasmático (RE) rugoso.

El proceso de maduración consiste en determinadas modificaciones de la cadena polipeptídica para obtener una proteína madura y funcional. Entre las modificaciones más habituales destacan:

• Cortes proteolíticos: Pérdida de la secuencia señal de la Met inicial, péptidos intermedios.
• Adición de grupos prostéticos: Cadenas glucídicas, lipídicas, cromógenos, coenzimas, metales, etc.
• Modificaciones covalentes de los aa: Fosforilaciones, metilaciones, acetilaciones, hidroxilaciones, etc.