Haplotipos: Conceptos Clave en Genética de Poblaciones
Los haplotipos son un conjunto de SNPs (polimorfismos de nucleótido único) a lo largo de un mismo cromosoma que se heredan como una unidad. Estas regiones del cromosoma se heredan en bloque debido a su menor propensión a la recombinación (formación de quiasmas).
La diferencia fundamental entre un haplotipo y los SNPs individuales radica en que los alelos dentro de un haplotipo están asignados a un cromosoma específico. Generalmente, cada individuo tendrá dos haplotipos para un fragmento del genoma, representados por los cromosomas paterno y materno.
Estos haplotipos son de gran utilidad, ya que proporcionan información sobre la recombinación, que es el intercambio físico del ADN durante la meiosis.
La información obtenida de este tipo de datos es importante, ya que nos permite localizar mutaciones que pueden ser causantes de alguna enfermedad mediante estudios de ligamiento, además de tener un profundo efecto sobre la extensión de asociaciones estadísticas entre la presencia de dos SNPs en el genoma, fenómeno conocido como desequilibrio de ligamiento (DL). El DL es una propiedad fundamental en los estudios de asociación del genoma completo (GWAS).
Este desequilibrio de ligamiento puede ser entendido como una asociación entre los SNPs; es decir, el conocimiento del genotipo de un SNP puede predecir el genotipo de otro SNP si la asociación (desequilibrio de ligamiento) es alta entre estos dos SNPs.
El cromosoma Y casi no sufre recombinación durante la meiosis (solo una pequeña parte pseudoautosómica puede recombinarse con el X). Por lo tanto, todo el cromosoma es un grupo de ligamiento. Esto lo hace particularmente importante en estudios forenses y de linaje paterno.
Clonación Molecular: Métodos y Vectores
Comparativa: Clonación In Vivo vs. PCR (In Vitro)
| Característica | Clonación In Vivo | PCR (In Vitro) |
|---|---|---|
| Principio | El fragmento de ADN de interés se introduce adecuadamente en una célula viva y se aprovecha la maquinaria replicativa para amplificarlo. | El fragmento de ADN de interés se replica en un tubo de ensayo en el que se generan artificialmente las condiciones apropiadas. |
| Duración y Automatización | La técnica es manual y dura varios días. | La técnica está automatizada y se lleva a cabo en horas. |
| Cantidad de Producto | Permite obtener prácticamente cantidades ilimitadas de la secuencia de interés. | Las cantidades de secuencias de interés están limitadas por el número de ciclos de replicación. |
| Longitud de Amplificación | Permite amplificar secuencias de ADN de incluso millones de pares de bases dependiendo del vector utilizado. | Niveles de amplificación menores, generalmente hasta 3.5 kb (aunque existen variantes para fragmentos más largos). |
Plásmidos: Vectores Esenciales en Biología Molecular
Los plásmidos son pequeñas moléculas circulares de ADN que se replican y se transmiten con independencia del cromosoma bacteriano.
De forma natural, constituyen el material genético móvil de las bacterias, funcionando como un medio de transporte de genes entre bacterias, incluyendo aquellos que confieren resistencia a antibióticos.
Los plásmidos permanecen de manera episomal en la bacteria, es decir, sin incorporarse en su genoma, y en ella puede haber múltiples copias del mismo plásmido.
Cuando una bacteria se reproduce, estos plásmidos se transmiten a las células descendientes por distribución equitativa del citoplasma bacteriano durante la división celular. Sin embargo, también pueden transmitirse a través de los pili entre las bacterias.
La replicación y transcripción plasmídica dependen de la maquinaria enzimática de la célula huésped.
Los plásmidos han sido manipulados genéticamente en el laboratorio con la finalidad de preservar solo las características deseables, eliminar el ADN innecesario y añadirle otras que no poseen de forma natural.
Los plásmidos utilizados como vectores de clonación generalmente tienen un tamaño que oscila entre 2 y 5 kb de ADN, lo que facilita el análisis y manipulación de los insertos incorporados.
Existen cientos de plásmidos disponibles comercialmente que ofrecen una amplia variedad de posibilidades en cuanto a las enzimas de restricción que se van a emplear para la clonación, la longitud del producto que se va a insertar y los marcadores de selección de las colonias transformadas. Entre los plásmidos más utilizados se encuentran pBluescript, pUC19, pBR322 y pGLO.
Bacteriófagos: Vectores Virales para la Clonación
Los bacteriófagos son virus que infectan de forma natural bacterias y se comportan como parásitos intracelulares obligados que se multiplican utilizando la maquinaria biosintética de las bacterias.
Al igual que los plásmidos, los bacteriófagos se replican de forma autónoma, portan información genética y pueden conferir a la bacteria nuevas propiedades o inducir procesos patológicos. Para convertirlo en un vector, el bacteriófago silvestre (virus natural) es modificado genéticamente. Estas modificaciones incluyen la adición de sitios de restricción específicos y la eliminación de genes no esenciales para la replicación, lo que permite la incorporación de fragmentos de ADN de mayor longitud que los plásmidos (de hasta 23 kb).
El bacteriófago lambda es el fago más utilizado como vector de clonación, y su genoma consiste en una molécula lineal de aproximadamente 45 kb, cuyos extremos, de 12 nucleótidos, contienen secuencias complementarias entre sí, denominados sitios cos. Estos sitios permiten la circularización de su genoma mediante la acción de una ligasa de la célula huésped.
Cósmidos: Vectores Híbridos para Grandes Insertos
Algunos estudios de genómica requieren la clonación de fragmentos de ADN de gran tamaño.
En estos casos, es recomendable utilizar los cósmidos, dado que pueden albergar insertos de hasta 45 kb.
Los cósmidos son vectores híbridos que combinan elementos de plásmidos (como genes de resistencia a antibióticos para selección) y los sitios cos de bacteriófagos (que permiten el empaquetamiento del ADN en partículas virales).
Los cósmidos derivados del fago P1 pueden admitir 85 kb de ADN exógeno. Además, contienen los genes de selección y un origen de replicación (ORI) del plásmido, lo que les permite replicarse de manera independiente del genoma bacteriano, al igual que los plásmidos.
Cromosomas Artificiales: BACs y YACs para Genomas Completos
Fragmentos de ADN de mayor tamaño (cientos de kilobases) pueden clonarse en cromosomas artificiales de bacterias (BAC) o levadura (YAC), que se replican como un cromosoma independiente dentro de bacterias o levaduras, respectivamente.
Este tipo de vectores son particularmente útiles para estudios de mapeo genómico, por su capacidad para almacenar fragmentos de gran tamaño.
Un BAC es un constructo derivado del factor de fertilidad F (plasmid F) capaz de regular la distribución equitativa de plásmidos después de la división bacteriana. Usualmente, aceptan insertos de 150 a 350 kb, aunque se han logrado clonar segmentos de hasta 700 kb.
Los YAC son cromosomas artificiales que contienen telómeros, origen de replicación (ORI), un centrómero de levadura y un marcador de selección para su identificación en las células que los contengan. Su capacidad de clonación varía de 100 a 1000 kb (1 Mb).
Técnicas de Detección de Ácidos Nucleicos
Dot Blot y Slot Blot: Detección Directa de Ácidos Nucleicos
Tras el aislamiento y separación de los ácidos nucleicos, estos se aplican directamente a la membrana sin una separación previa por tamaño (es decir, sin electroforesis).
La fijación se hace generalmente con vacío y en un molde cuyo pocillo puede tener forma de punto (dot blot) o ser lineal (slot blot).
Es posible realizar detecciones no solo cualitativas (positivo o negativo) sino también cuantitativas, utilizando como patrón diluciones seriadas de concentraciones conocidas del ácido nucleico de interés.
Southern Blot: Detección de Secuencias Específicas de ADN
El Southern blot es una técnica utilizada para detectar un gen o fragmento específico de ADN dentro de una mezcla compleja. El proceso inicia con la extracción de ADN de cualquier célula del organismo, excepto de los eritrocitos maduros, ya que carecen de núcleo y, por ende, de ADN. Esta extracción también puede hacerse a partir de cultivos celulares, líquido amniótico, vellosidades coriónicas o tejidos biopsiados. Una vez obtenido el ADN, se digieren con enzimas de restricción, generando múltiples fragmentos que luego se separan por electroforesis en un gel de agarosa según su tamaño. A continuación, el ADN se desnaturaliza químicamente, separando sus dos cadenas complementarias. Estos fragmentos se transfieren del gel a una membrana sólida, como nitrocelulosa o nailon, utilizando métodos como capilaridad, vacío o electrotransferencia. Esta transferencia crea una réplica exacta del patrón de fragmentos, pero en un soporte más resistente. Luego, se aplica una sonda marcada con una molécula detectable (por ejemplo, radiactiva) que se unirá específicamente al fragmento de interés mediante el proceso de hibridación, es decir, la formación de pares de bases complementarias entre la sonda y el ADN diana. Finalmente, la señal emitida por la sonda, como la radiactividad, se detecta mediante autorradiografía (placa de rayos X), revelando únicamente la presencia del fragmento deseado.
Northern Blot: Detección de Secuencias Específicas de ARN
Diferencias con el Southern Blot
Es la contraparte del Southern blot y se utiliza ARN como ácido nucleico de interés, en lugar de ADN.
A diferencia del Southern blot, con esta técnica no se utilizan enzimas de restricción, dado que las moléculas de ARN son generalmente más pequeñas y no requieren fraccionamiento enzimático para su análisis.
Sin embargo, prácticamente comparten todos los demás pasos, tales como la electroforesis, la desnaturalización (necesaria para romper estructuras secundarias que el ARN de cadena sencilla puede formar), la transferencia y la hibridación con una sonda.
Aplicaciones del Northern Blot
Es una herramienta muy útil para el estudio de los productos de la transcripción génica (ARNm, ARNr, ARNt, etc.) y de su regulación, ya que se pueden estudiar las potenciales variaciones en la abundancia de especies de ARN en diferentes condiciones experimentales o comparar la expresión génica entre condiciones clínicas normales y patológicas.